LAPORAN
BIOTEKNOLOGI HASIL PERAIRAN
‘’Elektroforesis SDS-PAGE Gel’’
Disusun oleh :
GIANTO
130254244414
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN
FAKULTAS ILMU
KELAUTAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS
MARITIM RAJA ALI HAJI
TANJUNGPINANG
2015
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Elektroforesis adalah suatu teknik
pemisahan yang memisahkan analit berdasarkan kemampuannya bergerak dalam medium
konduksi yang biasanya berupa larutan buffer dan akan memberikan respons
setelah diberikan medan listrik (Harvey, 2000).
Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan
untuk analisa campuran protein secara kualitatif adalah SDS ‐ PAGE ( Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide
Gel Electroforesis ). Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi – kisi tersebut
berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan
bisa krilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan
berat molekul suatu protein disamping
untuk memonitor pemurnian protein (Wilson
dan Walker, 2000). SDS ‐ PAGE
dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion rendah dan dapat menentukan
apakah suatu protein termasuk monomerik atau
oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit
atau monomer.
Fungsi SDS (sodium dodecyl sulfat)
merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan
negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS padametode SDS-PAGE
(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif
pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein,
mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk,ukuran, dan
muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stukturkompleks protein
dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatumedan listrik
(Anam, 2009)
Penggunaan SDS ‐ PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif
pada protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat
SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut (Dunn,1989).
Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang mengandung
β ‐
merkaptoetanol (berfungsi
untuk mereduksi ikatan isulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan asli protein akan
digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat sehingga kompleks protein
‐
SDS memiliki rasio muatan
per berat molekul yang konstan. (Hames, 1987).
merupakan elektroforesis yang
menggunakan gel sebagai fasediam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA
dan protein menjadi pita-pitayang masing-masing terdiri atas
molekul-molekuldengan panjang yang sama.Elektroforesis gel merupakan teknik
memisahkan suatu makromolekul dengan caramemberi gaya pada makromolekul
tersebut untuk melewati medium berisi gel yangdibantu dengan tenaga listrik.
Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan lajuperpindahannya melewati suatu gel
di bawah pengaruh medan listrik. Media atau gelyang dapat digunakan yaitu
agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel(elektroforesis protein).
Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran molekul,konsentrasi gel, bentuk
molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutanbuffer
elektroforesis (Martin, 2006)
1.2 Tujuan
Tujuan analisis protein dengan metode
elektroforesis yaitu untuk memisahkanprotein berdasarkan berat molekul dengan
menggunakan matriks penyangga akrilamid. Selain itu dengan elektroforesisakan
diketahui jenis protein dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis.
BAB II
METODOLOGI
2.1 Materi
· Alat
ü Glass
plates
ü Casting
frame
ü Casting
stand
ü tisue
ü Not
leaking
· Bahan
ü sampel
ü Acrylamide
ü 1.5
M Tris, pH 8.8 (Resoving Gel dan 0.5 M Tris, pH 6.8 (stacking Gel)
ü SDS
ü dH2O
ü Ammonium
Persulphate
ü TEMED
ü buffer
2.2 Metoda
A. Prosedur kerja
· Persiapan Gel
1.
Alat
dan bahan pembuatan gel disiapkan. Kaca dipasang pada penjepitnya.
2.
Campuran
bahan separating gel disiapkan sesuai dengan resep dan konsentrasinya.
3.
Campuran
separating gel dihomogenkan dengan cepat agar tidak segera mengeras.
4.
Campuran
separating gel dimasukkan pada gel caster dengan bantuan pipet, ikuti dengan pemberian aquades agar permukaan
gel rata dan oksigen tidak ada.
5.
Ruang
disisakan untuk stacking gel.
6.
Setelah
separating gel mengeras, sisa aquades dibuang.
7.
Campuran
stacking gel disiapkan.
8.
Campuran
stacking gel dihomogenkan dengan cepat.
9.
Campuran
stacking gel dituang di atas separating gel dan sisir (comb) segera dipasang
diatas stacking gel.
10. Gel dibiarkan hingga mengeras.
11. Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari
penjepitnya.
12. Gel pada kaca dipasang pada alat
elektroforesis dan running buffer dituang.
· Persiapan Sampel
1.
Sampel
protein dan tracking dye (RSB) disiapkan.
2.
Sampel
direbus pada suhu 100°C selama 5 menit.
3.
Sampel
didinginkan pada suhu ruangan.
· Elektroforesis Gel
1.
Sampel
protein dimasukkan ke dalam gel melalui ujung atas stacking gel sesuai dengan
kebutuhan / sumur.
2.
Power
supply dinyalakan.
3.
sampel
diproses atau running dengan memberikan tegangan listrik sebesar 120 V selama
60-90 menit.
4.
Gel
dilepas dari kacanya.
· Staining dengan Coomasie Briliant Blue
1.
Gel
direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue
2.
Rendaman gel dalam staining solution Coomasie
Brilliant Blue R – 250 diletakkan di dalam shaker selama 20 - 30 menit.
· Destaining
1.
Pewarna
pada gel dihilangkan dalam rendaman destain solution sambil tetap di shaker.
2.
Lakukan
destaining semalam di atas shaker sampai gel kelihatan bersih.
3.
Gel
siap discan dan dianalisa hasilnya.
4.
Hitung
BM protein pada band protein yang tampak pada gel menggunakan grafik regresi linear.
BAB III
PEMBAHASAN
3.1 Elektroforesis SDS – PAGE
Elektroforesis adalah sebuah metode
untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen
DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk
memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui
medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan
dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA
yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui
suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan
negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada
rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya (Yuwono, 2008).
3.2 Fungsi SDS pada metode SDS-PAGE
SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan
detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif
dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE
(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif
pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein,
mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran,
dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks
protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan
listrik (Anam, 2009).
3.3 Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE
Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah
difusi akibat timbulnya panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid
sering dimanfaatkan untuk memisahkan molekul protein yang kecil. Konsentrasi
akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein. Pada proses pembuatan gel,
akrilamid akan berpolimerisasi
secara spontan bila tidak ada oksigen (Prihanto, 2011).
3.4 Fungsi pewarnaan gel pada metode elektroforesis
Pewarnaan atau staining pada gel
merupakan bagian dari metode SDS-PAGE. Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis
yaitu untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada
metode elektroforesis protein terdiri dari commasie blue staining dan silver
salt staining. Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak
migrasi pita-pita protein terbentuk pada gel pemisah. Jarak migrasi diukur dan
dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol. Sedangkan
pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis
(Anam, 2009).
3.5 Stacking gel
Stacking gel merupakan salah satu gel
yang digunakan dalam SDS-PAGE. Stackinggel merupakan gel pengumpul atau gel
penimbun yang terletak pada bagian atas.Stacking gel dibuat dengan campuran
antara akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, sterilaquades, SDS 10%, Ammonium
Phosphate (APS) 10%, dan temed (Utami, 2007).
Stacking gel diperlukan dalam
elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran ( well ), selain itu digunakan untuk menimbun atau
memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki
gel pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel
bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, protein
akan tertarik ke bagian bawah aruslistrik. Protein yang memiliki berat molekul
paling kecil bergerak cepat sehingga tertariksampai bagian bawah gel, sedangkan
protein yang memiliki berat molekul paling besarakan berada pada bagian atas
dari gel (Utami, 2007).
BAB IV
KESIMPULAN
ü Stacking gel merupakan salah satu gel yang digunakan dalam SDS-PAGE. Stacking gel merupakan gel pengumpul atau gel penimbun yang terletak ada bagian atas.
ü Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel pemisah
DAFTAR PUSTAKA
Prihanto, A.A. 2011. Teknik Molekuler:
Elektroforesis.http://asep.lecture.ub.ac.id.
Diakses Tanggal 21
Desember 2015
Utami, E.S.W., dkk. 2007. Sintetis Protein Selama
Embriogenesis Somatik Anggrek Bulan Phalaenopsis amabilis
(L.). Jurnal Biodiversitas. Vol.8, No.3, Hal.188-19
Tidak ada komentar:
Posting Komentar